简介

结核病是由结核分枝杆菌引起，结核病是一种危急生命的疾病，从感染开始，随着感染的发展，肺部会发生损伤导致呼吸困难，然后损伤其他器官。结核分枝杆菌通过空气传播，最开始感染肺部。

感染结核分枝杆菌的病人（肺结核）的痰液含有大量细菌存在。因此，对于痰液结核分枝杆菌的检测可以对结核进行确诊。结核分枝杆菌检查的经典方法是通过将痰液涂片到玻璃平板上，染色，然后再用显微镜进行镜检。然而，当细菌的量很小时，通过显微镜并不总能检测到细菌。如果检测不到细菌，需要先对痰液进行培养后再进行检测。然而，因为结核分枝杆菌生长缓慢，通常需要通过4-8周的时间才能得到结果。为了加快对于微量结核分枝杆菌的检测，使用基因扩增的检测方法，例如PCR方法，已经在最近几年被引入。

本文主要内容是使用“MagDEADxSV”（它是一种由PSS公司开发，主要用于全自动核酸提取系统的试剂）试剂从预先处理过的痰液标本提取出结核分枝杆菌DNA的数据。

方法

痰液标本需要使用以下两种方法（A或B)中的一种进行预处理：

A.N-乙酰-L-半胱氨酸（NALC)法：

1.3mL的痰液标本，加入等体积的NALC-NaOH溶液（2.5gN-乙酰-L-半胱氨酸，25mL40%的NaOH,25mL1M柠檬酸钠，mL不含DNA酶和RNA酶的水），混合溶液在室温下搅拌15min;

2.2.8mL磷酸缓冲盐溶液（PBS、pH7.4)加入1中制备的混合溶液中，搅拌；

3.2中制备的混合溶液在g离心力下离心15min,上清液被弃用；

4.沉淀物用uLpH7.4的PBS进行重悬浮；

5.4中制备的混合溶液在95℃条件下加热20min.

B:蛋白酶K(PK)法：

1.uL痰液标本，加入等体积的蛋白酶K缓冲液，混合溶液搅拌10s;

2.1中制备的混合溶液在55℃条件下加热1h.

使用全自动基因测试系统geneLEADXIIPlus（由PSS公司提供），核酸提取试剂MagDEADxSV以及一台核酸提取设备（由X公司提供）从uL预处理过的痰液悬浮液提取核酸，通过两家公司产品提取得到结核分枝杆菌的核酸，通过荧光定量PCR进行测定。

结果

结核分枝杆菌（MTB）被加入到14份经过NALC方法预处理过（上述预处理方法A）的MTB阴性的痰液中（A到N），提取的性能通过荧光定量PCR检测进行比较。荧光定量PCR得到的Ct值的比对数据见图1.使用MagDEADxSV试剂能够从所有的样本中都检测出MTB，而它的检测性能比起X公司设备提取得到的DNA来，相等或者优于。内部质控（EIC）也进行了检测。

图1:使用加了含有MTB的痰液悬浮液进行提取测试的结果

结核分枝杆菌（MTB)被加入到用PK法预处理过（上述预处理方法B）的MTB阴性痰液标本（A到D），最终的MTB浓度分别为0、、0、00拷贝/mL，然后进行提取。荧光定量PCR得到的Ct值的比对数据见图2.通过MagDEADxSV试剂能够检测到的最低浓度为0拷贝/m；检测灵敏度与X公司的核酸提取设备的能力相同。内部质控（EIC）也进行了检测。

MTB

EIC

图2:使用加了MTB的痰液悬浮液进行检测灵敏度测试的结果

QCMD样本(MTB)的提取实验，方法B被用于痰液样本的预处理，结果见图3.依据期望结果，用MagDEADxSV试剂盒提取得到的核酸与用X公司的设备提取得到的核酸结果都表现出了良好的符合性。

图3:使用QCMD样本进行提取实验括号里的数据是荧光定量PCR的结果

结论

我们成功地通过使用PSS公司的MagDEADxSV试剂，从预处理过的痰液样本提取结核分枝杆菌DNA和荧光定量PCR的检测。

参考文献

1)Shah和Dye.使用二硫苏糖醇替代N-乙酰-L-半胱氨酸用于日常痰液的预处理以及结核分枝杆菌的培养。

AmericanReviewofRespiratoryDisease.94:

产品信息

（文章内容由日立诊断提供）

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